Manipulación Genética

Manipulación Genética
La manipulación genética consiste en las técnicas dirigidas a modificar el caudal hereditario, de alguna especie, con fines variables, desde la superación de enfermedades de origen genético (terapia genética) o con finalidad experimental (conseguir un individuo con características no existentes hasta ese momento). Llegar a la posibilidad de realizar modificaciones en la composición hereditaria de una especie requiere una serie de pasos, de los cuales unos cuantos ya han sido dados. El primero de ellos fue el descubrimiento del cromosoma humano, formado por ácido que conforma los genes, los cuáles a su vez se “ubican” en los cromosomas. Cada especie tiene un número específico de cromosomas, los humanos contamos con 23 pares, es decir, 46 cromosomas.

Hay que conocer el hecho de que la información genética es un conjunto de instrucciones que se transmiten en un único “idioma”: esto quiere decir que es universal, por lo que la diferencia entre un clavel, un rinoceronte y una persona humana es la cantidad de información.

Para entender adecuadamente el concepto de manipulacion conozcamos términos asociados a ésta:

1) Enzimas de restricción:
Una enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.

El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de la ruptura de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercanía (Apareamiento de Watson & Crick).

Restricción de SmaI dejando extremos romos. Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo de vectores están los Plásmidos, moléculas circulares de ADN halladas en las bacterias.

Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas Isoesquizómeros. Por ejemplo, están los isoesquizómeros Asp718 y KpnI.

Tipos de enzimas de restricción
Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción:

Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.

Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para clonación de genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP.

Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.

Sistemas de restricción-modificación (M-R)

El sistema de restricción-modificación (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exógenos (normalmente víricos) que ingresen en la bacteria, distinguiéndolo del ADN propio, análogo a un sistema inmune. El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases específicas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infección del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas “K12” y “B”). Este sistema consta de dos partes:

Restricción: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exógenos para evitar la “promiscuidad” en los intercambios genéticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad genética o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a través de cortes mediante endonucleasas de restricción a los DNA exógenos que ingresen a la bacteria.

Modificación: Consiste en la introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual está catalizado por una metilasa específica.

2) Clonación

La clonación puede definirse como el proceso por el que se consiguen copias idénticas de un organismo ya desarrollado, de forma asexual. Estas dos características son importantes:

§ Se parte de un animal ya desarrollado, porque la clonación responde a un interés por obtener copias de un determinado animal que nos interesa, y sólo cuando es adulto conocemos sus características.

§ Por otro lado, se trata de hacerlo de forma asexual. La reproducción sexual no nos permite obtener copias idénticas, ya que este tipo de reproducción por su misma naturaleza genera diversidad.

Pero existen diferentes tipos de clonación dependiendo al nivel al que se realice, por ejemplo:

Clonación molecular
La clonación molecular se utiliza en una amplia variedad de experimentos biológicos y las aplicaciones prácticas que van desde la toma de huellas dactilares a producción de proteínas a gran escala. En la práctica, con el fin de amplificar cualquier secuencia en un organismo vivo, la secuencia a clonar tiene que estar vinculada a un origen de replicación; que es una secuencia de ADN

-Transfección: Se introduce la secuencia formada dentro de células.

-Selección: Finalmente se seleccionan las células que han sido transfectadas con éxito con el nuevo ADN.

Inicialmente, el ADN de interés necesita ser aislado de un segmento de ADN de tamaño adecuado. Posteriormente, se da el proceso de ligación cuando el fragmento amplificado se inserta en un vector de clonación: El vector se linealiza (ya que es circular),usando enzimas de restricción y a continuación se incuban en condiciones adecuadas el fragmento de ADN de interés y el vector con la enzima ADN ligasa.

Tras la ligación del vector con el inserto de interés, se produce la transfección dentro de las células, para ello las células transfectadas son cultivadas; este proceso, es el proceso determinante, ya que es la parte en la que vemos si las células han sido transfectadas exitosamente o no.

Clonación celular
Clonar una célula consiste en formar un grupo de ellas a partir de una sola. En el caso de organismos unicelulares como bacterias y levaduras, este proceso es muy sencillo, y sólo requiere la inoculación de los productos adecuados.

Sin embargo, en el caso de cultivos de células en organismos multicelulares, la clonación de las células es una tarea difícil, ya que estas células necesitan unas condiciones del medio muy específicas.

Una técnica útil de cultivo de tejidos utilizada para clonar distintos linajes de células es el uso de aros de clonación (cilindros). De acuerdo con esta técnica, una agrupación de células unicelulares que han sido expuestas a un agente mutagénico o a un medicamento utilizado para propiciar la selección se ponen en una alta dilución para crear colonias aisladas; cada una proviniendo de una sola célula potencialmente y clónicamente diferenciada.

En una primera etapa de crecimiento, cuando las colonias tienen sólo unas pocas células; se sumergen aros estériles de poliestireno en grasa, y se ponen sobre una colonia individual junto con una pequeña cantidad de tripsina. Las células que se clonan, se recolectan dentro del aro y se llevan a un nuevo contenedor para que continúe su crecimiento.

Clonación terapeutica o andropatrica
La clonación terapéutica o andropatrica tiene fines terapéuticos, y consiste en obtener células madre del paciente a tratar, atendiendo al siguiente experimento: Se coge una célula somática cualquiera del paciente a tratar, se aísla el núcleo con los cromosomas dentro y se desecha todo lo demás. Por otro lado, obtenemos un óvulo sin fecundar y extraemos su núcleo con sus cromosomas, para así introducir en éste el núcleo aislado anteriormente de la célula somática. A continuación se estimula el óvulo con el núcleo comenzando así la división celular del embrión clonado.

Este embrión será un clon del paciente a tratar. Dejamos que el embrión se desarrolle hasta llegar a la fase clave: el blastocisto. En esta fase extraemos la célula madre de la masa celular obtenida que tiene el mismo ADN que el paciente, y por lo tanto no causará rechazo cuando se inyecte.

Un ejemplo de este tipo de clonación es la clonación de la oveja Dolly:

3) Alimentos Transgénicos:

Los alimentos sometidos a ingeniería genética o alimentos transgénicos son aquellos que fueron producidos a partir de un organismo modificado genéticamente mediante ingeniería genética. Dicho de otra forma, es aquel alimento obtenido de un organismo al cual le han incorporado genes de otro para producir una característica deseada. En la actualidad tienen mayor presencia alimentos procedentes de plantas transgénicas como el maíz, la cebada o la soja.

La ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante es la ciencia que manipula secuencias de ADN (que normalmente codifican genes) de forma directa, posibilitando su extracción de un taxón biológico dado y su inclusión en otro, así como la modificación o eliminación de estos genes. En esto se diferencia de la mejora clásica, que es la ciencia que introduce fragmentos de ADN (conteniendo como en el caso anterior genes) de forma indirecta, mediante cruzamientos dirigidos. La primera estrategia, la de la ingeniería genética, se circunscribe en la disciplina denominada biotecnología vegetal. Cabe destacar que la inserción de grupos de genes mediante obtención de híbridos (incluso de especies distintas) y otros procesos pueden realizarse mediante técnicas de biotecnología vegetal que no son consideradas ingeniería genética, como puede ser la fusión de protoplastos.

Beneficios : Los caracteres introducidos mediante ingeniería genética en especies destinadas a la producción de alimentos buscan el incremento de la productividad (por ejemplo, mediante una resistencia mejorada a las plagas) así como la introducción de características de calidad nuevas. Debido al mayor desarrollo de la manipulación genética en especies vegetales, todos los alimentos transgénicos corresponden a derivados de plantas. Por ejemplo, un carácter empleado con frecuencia es la resistencia a herbicidas, puesto que de este modo es posible emplearlos afectando sólo a la flora ajena al cultivo. Cabe destacar que el empleo de variedades modificadas y resistentes a herbicidas ha disminuido la contaminación debido a estos productos en acuíferos y suelo, si bien es cierto que no se requeriría el uso de estos herbicidas tan nocivos por su alto contenido en glifosato (GLY) y amonio glifosinado (GLU)si no se plantaran estas variedades, diseñadas exclusivamente para resistir a dichos compuestos.

Las plagas de insectos son uno de los elementos más devastadores en agricultura. Por esta razón, la introducción de genes que provocan el desarrollo de resistentes a uno o varios órdenes de insectos ha sido un elemento común a muchas de las variedades patentadas. Las ventajas de este método suponen un menor uso de insecticidas en los campos sembrados con estas variedades, lo que redunda en un menor impacto en el ecosistema que alberga al cultivo y por la salud de los trabajadores que manipulan los fitosanitarios.

*Tecnología Terminator: pertenece a GURT (acrónimo inglés de Grupo de Tecnologías de Restricción de Uso). Terminator es el nombre coloquial con que se conoce los métodos propuestos para la restricción del uso de vegetales genéticamente modificados, por medio de obtener que la segunda generación de semillas devenga estéril.

Esta tecnología fue inicialmente desarrollada por el Departamento de Agricultura de EE.UU. y la Delta and Pine Company en los años 1990s, y aún no fue incorporada a cultivares comerciales, y por supuesto no está autorizada su venta. Debido a que algunos inversionistas expresaron preocupación en que ésta tecnología pudiese generar dependencia en los países más pobres, Monsanto, la compañía dedicada a la producción de bienes para usos agrícolas, consideró no comercializar esta tecnología, aún si llegase a estar comercialmente disponible.

Este tipo de GURT produce semillas estériles en el sentido en que un granjero que hubiese adquirido semillas que incorporen la tecnología V-GURT no tuviese la posibilidad de guardar estas semillas de la cosecha con el propósito de una futura siembra. Esto no tendría un impacto inmediato sobre el amplio volumen de granjeros que utilizasen semillas híbridas, siendo que ellos no producirían sus propias semillas para fines de siembra, sino que comprarían semillas híbridas especiales de compañías especializadas. Esta tecnología actúa a nivel de la variedad de la planta: de ahí la ‘V’ del nombre V-GURT. Los productores de las cosechas genéticamente mejoradas utilizarían esta tecnología para proteger sus productos contra un uso no autorizado.

Posibles ventajas de la tecnología GURT

Incentivos para el desarrollo de nuevas plantas

En territorios en que los sistemas de protección a la propiedad intelectual son ineficientes o aun inexistentes, los GURT podrían ser la alternativa para incentiva a las compañías biotécnicas al desarrollo de nuevas plantas.

Administración mejorada de la granja
Semillas inviables de plantas V-GURT reducirán la propagación de plantas de presencia espontánea. Estas plantas usualmente generan problemas económicos en los sistemas de granja de más grande y mecanizada escala que incluyen rotación de cultivos.

Calidad mejorada del grano
Bajo condiciones cálidas y húmedas de cosecha, el grano no-V-GURT puede germinar, lo que reduce la calidad final del total de grano producido. Se especula que este problema no habría de ocurrir con el uso de variedades de grano V-GURT.

Seguridad biológica
La tecnología V-GURT puede impedir el escape de los transgenes hacia las variedades naturales originales, previniendo así todo impacto sobre la biodiversidad. Las cosechas modificadas para la producción de productos no alimenticios pueden estar equipadas con tecnología GURT que prevenga la transmisión accidental de estos rasgos a aquellas cosechas destinadas para alimentación.

4) Uso de Vectores
Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

Tipos de vectores
Hay muchos vectores de clonación, que difieren en la especificidad de la célula huésped, el tamaño de los insertos que pueden transportar y en características como el número de copias que producen y el número y tipo de genes marcadores que contienen, entre otras.

° Plásmidos
Los plásmidos fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas.

° Bacteriófago lambda
El genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser utilizado de vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar calvas.

Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una enzima de restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento de ADN de interés y los unimos con una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células huesped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb ( kilobases).

° Cósmidos
Los cósmidos son vectores hibridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, además contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.

Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes marcadores de selección y a un grupo de enzimas de restricción para insertar ADN exógeno. Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100 a 1000 kb.

° BAC
Un BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plásmido de fertilidad ( factor F ) de bacterias. El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana. Los BAC pueden transportar insertos de hasta 300 kb.