Análisis de ADN

El término sistemática molecular es utilizado para referirse a la sistemática macromolecular: el uso del ADN y del ARN para inferir relaciones de parentesco entre los organismos (también llamados, para evitar confusiones, análisis moleculares de ADN, que implican análisis de secuencias de ADN entre otros métodos). Si bien técnicamente, los métodos que implican el uso de isozimas y flavonoides también son moleculares, usualmente son tratados en apartados diferentes.

La aplicación de la información sobre los ácidos nucleicos a la Biología Sistemática ha tenido un desarrollo espectacular a partir de la década de los 90. Los datos moleculares han revolucionado la forma en que la Sistemática establece relaciones de parentesco, aunque no por las razones sugeridas en un primer momento.



ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.

La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.



PRUEBA DE PATERNIDAD

Una prueba de paternidad es aquella que tiene como objeto probar la paternidad, esto es determinar el parentesco ascendente en primer grado entre un individuo y un hombre (presunto padre). Los métodos para determinar esta relación han evolucionado desde la simple convivencia con la madre, la comparación de rasgos, Tipo de sangre ABO, análisis de proteínas y antígenos HLA. Actualmente la prueba idónea es la prueba genética basándose en polimorfismo en regiones STR.

La prueba de paternidad genética se basa en comparar el ADN nuclear de ambos. El ser humano al tener reproducción sexual hereda un alelo de la madre y otro del padre. Un hijo debe tener para cada locus un alelo que provenga del padre. Esta comparación se realiza comparando entre 13-19 locus del genoma del hijo, del presunto padre y opcionalmente de la madre, en regiones que son muy variables para cada individuo llamadas STR (Short Tandem Repeat).

Para determinar estadísticamente la exactitud de la prueba, se calcula el indice de paternidad, el cual determina la probabilidad que no exista una persona con el mismo perfil de alelos entre su raza. La cantidad de locus es determinada por la cantidad de marcadores genéticos (que limitan los locus) utilizados, a mayor cantidad de marcadores mayor exactitud. Con el uso de 15 marcadores se puede tener exactitudes de alrededor de 99,999%. Sin embargo esta exactitud puede aumentar según la ocurrencia de alelos extraños en cada individuo.

Cuando no se cuenta con muestras del presunto padre, se puede obtener un indice de paternidad utilizando muestras de los padres paternos. También es posible obtener muestras de prenatales mediante procedimiento de amniocentesis y Vellosidades coriónicas.

Existen pruebas de paternidad con fines informativos o pruebas de paternidad con fines legales. Las pruebas legales requieren validación de la identidad y custodia de las muestras. En varios paises la interpretación legal de varios derechos constitucionales señala que se tiene que tener consentimiento voluntario para la obtención de muestras para las pruebas de ADN.


DNA PROFILING

Huella genética (también llamada pruebas de ADN o análisis de ADN) es una técnica utilizada para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su ADN. Su invención se debe el doctor Alec Jeffreys en la Universidad de Leicester en 1984[1] y fue utilizada por primera vez en medicina forense para condenar a Colin Pitchfork en los asesinatos de Narborough (UK) en 1983 y 1986.[2]

La técnica se basa en que dos seres humanos tienen una gran parte de su secuencia de ADN en común y para distinguir a dos individuos se puede explotar la repetición de secuencias altamente variables llamada microsatélites. Dos seres humanos no relacionados será poco probable que tengan el mismo número de microsatélites en un determinado locus. En el SSR/STR de perfiles (que es distinto de impronta genética) la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utiliza para obtener suficiente ADN para luego detectar el número de repeticiones en varios Loci. Es posible establecer una selección que es muy poco probable que haya surgido por casualidad, salvo en el caso de gemelos idénticos, que tendrán idénticos perfiles genéticos pero no las huellas dactilares.

La huella genética se utiliza en la medicina forense, para identificar a los sospechosos con muestras de sangre, cabello, saliva o semen. También ha dado lugar a varias exoneraciones de condenados. Igualmente se utiliza en aplicaciones como la identificación de los restos humanos, pruebas de paternidad, la compatibilidad en la donación de órganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el establecimiento del origen o la composición de alimentos. También se ha utilizado para generar hipótesis sobre las migraciones de los seres humanos en la prehistoria.

Los microsatélites muestran una mayor variación que el resto del genoma ya que en ellos se encuentran unas secuencias en distinta repetición y con diferente grado de recombinación debido a la inestabilidad del locus.

Técnicas:
Estas variaciones son detectables con las siguientes técnicas:

RFLP
El análisis consiste en hacer un Southern Blotting (o "Southern blot" que es un método de biología molecular que sirve para verificar si una determinada secuencia de ADN está o no presente en una muestra de ADN analizada) y usar sondas específicas para detectar los VNTR (repeticiones en tandem de número variable).

En primer lugar el ADN que se va a analizar se separa de otros materiales. A continuación, debe cortarse en piezas de diferentes tamaños usando enzimas de restricción, que son proteínas que cortan el ADN sin dañar las bases. las piezas son clasificadas por tamaño mediante electroforesis en gel. Las piezas con carga positiva se van a la parte superior. El ADN que tiene una ligera carga negativa natural es atraído hacia el fondo. Las piezas más pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel, por lo que será aún más hacia la parte inferior de las piezas grandes. Al separar las piezas por tamaño, los más altos se mantienen arriba y los más pequeños debajo. Luego por calor o solución alcalina, se aplica gel con el fin de desnaturalizar el ADN y se separa en fragmentos individuales. Una vez realizado esto el ADN esta ahora listo para ser analizados utilizando una sonda radiactiva de reacción de hibridación.

Para hacer la sonda radiactiva, se necesita la polimerasa del ADN. El ADN que se va someter a la radiactividad se coloca en un tubo de ensayo. A continuación se agrega la polimerasa en el tubo. Se disuelve y se espera a que comience a funcionar. Como los parches de polimerasa de ADN rompen el ADN, los actuales son sustituidos por los nuevos nucleotidos en el tubo. Cada vez que la muestra tenga una base Guanina, la Citosina será puesto en radiactividad. En la repetición del ADN, la polimerasa también se vuelve radioactiva. Las piezas radioactivas están listas para su utilización. Ahora la sonda radioactiva puede ser usada para crear una reacción de hibridación. La hibridación sucede cuando dos secuencias genéticas se unen a causa del hidrógeno que se encuentra en los pares de las bases. Hay dos de estos entre Adenina o Timina y tres de Citosina o Guanina. Para realizar la hibridación el ADN tiene que estar desnaturalizado.

El ADN desnaturalizado radioactivo y la sonda deber ser puestos en una bolsa de plástico con líquido salino y sellado fuertemente. La sonda se adherirá a la desnaturalización de ADN dondequiera que se encuentre de forma apropiada. La sonda y el ADN no tienen que encajar de forma exacta. Este proceso termina haciendo un patrón de ADN de las huellas digitales. Toda persona tiene un VNTRs que ha heredado de uno de sus padres y los VNTRs son únicos para cada persona.

PCR
Consiste en aplicar la técnica de PCR para amplificar regiones específicas con los cebadores adecuados. Con al invención de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) la tecnología genética tuvo un importante avance en la capacidad de recuperación de información a partir de muestras muy pequeñas. PCR consiste en la amplificación de regiones específicas de ADN usando temperatura y una enzima polimerasa termoestable junto con fluorescencia etiquetada en una secuencia específica del ADN. Existen kits comerciales que utilizan polimorfismos de núcleotido único (SNP) de discriminación disponible, estos kits de uso de PCR usados para amplificar regiones específicas con variaciones conocidas e hibridación con sondas de anclado en tarjetas, lo que resulta en una mancha de color correspondiente a una orden en particular.

Una de las principales quejas en contra del RFLP es que es lento y que requiere grandes cantidades de ADN para ser útil. Esto llevo a métodos basados en PCRque requieren menores cantidades de ADN que pueden ser también más degradados que los utilizados en análisis de RFLP.

Los ensayos de PCR son extremadamente valiosos para identificar nuevos miembros de una familia génica.